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多肽縮合的試劑

目前多肽合成中，主要采用羧基活化方法來完成接肽反應(yīng)，最早使用的是將氨基酸活化為酰氯，疊氮，對稱酸酐以及混合酸酐的方法，但是由于這些條件下，存在氨基酸消旋，以及反應(yīng)試劑危險以及制備比較復(fù)雜，逐漸被后來的縮合試劑取代，按照其結(jié)構(gòu)可以分為兩種：縮合試劑主要有：碳二亞胺型，鎓鹽型（Uronium）。

1.2.1．碳二亞胺型
主要包括：DCC，DIC，EDC.HCl等。采用DCC進行反應(yīng)，由于反應(yīng)中生成的DCU，在DMF中溶解度很小，產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用在固相合成中，但是由于其價格便宜，在液相合成中，可以通過過濾除去，應(yīng)用仍然相當(dāng)廣泛。EDC.HCl因為其水溶解性的特點，在多肽與蛋白的連接中使用比較多，而且也相當(dāng)成功。但是該類型的縮合試劑的一個最大的缺點，就是如果單獨使用，會有比較多的副反應(yīng)，但是研究表明如果在活化過程中添加HOBt，HOAt等試劑，可以將其副反應(yīng)控制在很低的范圍。其反應(yīng)機理如下：

圖2 DIC活化反應(yīng)機理

1.2.2．鎓鹽型
鎓鹽型縮合試劑反應(yīng)活性高，速度快，現(xiàn)在使用非常廣泛，主要包括：HBTU，TBTU，HATU，PyBOP等。該試劑使用過程中需要添加有機堿，如，二異丙基乙胺（DIEA），N-甲基嗎啉（NMM），該試劑加入后，才能活化氨基酸。其反應(yīng)機理如下：

固相合成中常用樹脂
固相多肽合成中樹脂，一般都是聚苯乙烯-二乙烯苯材料，大小在75-150μm，交聯(lián)度在1-2%之間，現(xiàn)在使用的大多是1%，因為這種交聯(lián)度下，樹脂在DMF，DCM中具有很好的溶脹性能，立體上是一個空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，反應(yīng)物分子可以在樹脂內(nèi)部自由移動。樹脂中最關(guān)鍵的部分是連接手臂，它一端連接在樹脂上，一端作為反應(yīng)位點。目前廣泛使用的樹脂有：PAM，MBHA，Wang，2-Cl-Trt，Rink-Amide-MBHA等。其中PAM，MBHA是用在BOC策略中，因為其對酸非常穩(wěn)定，需要在HF，TFMSA等強酸條件下才能夠切割下來。

固相合成切割方法
固相多肽合成完成之后，必須選擇合適的切割試劑將多肽從樹脂上切割下來，然后經(jīng)過冰乙醚沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過HPLC分離純化，冷凍干燥得到最后多肽產(chǎn)品。
由于選擇的樹脂不同，氨基酸序列不同，在切割時候，選擇的切割方法也不完全相同，一般都是選擇酸性條件下切割的條件，對于PAM，MBHA樹脂，一般采用HF切割，切割過程中需要添加對甲苯酚，對巰基苯酚，苯甲醚等試劑。而對于Wang，Rink-Amide，Trt樹脂，一般采用TFA切割，切割過程中加入，乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。
這些添加試劑主要作為碳正離子俘獲試劑使用，目的是俘獲切割反應(yīng)過程中生成的碳正離子，減少這些碳正離子對部分氨基酸側(cè)鏈的進攻導(dǎo)致的副反應(yīng)，比較容易產(chǎn)生副反應(yīng)的氨基酸有：Trp，Tyr。切割試劑用量一般10-15ml/g樹脂。
常用的切割配比：HF/p-cresol/p-thiocresol（90/5/5），TFA/TIS/EDT/H2O（94/1/2.5/2.5），反應(yīng)一般是在室溫條件下2h-4h。

困難序列多肽合成
固相多肽合成中也經(jīng)常遇到多肽合成失敗或合成效率很低的問題，這里面的主要原因是由于多肽序列引起的，因為有些多肽序列在樹脂上形成β-折疊，改變了樹脂的溶脹性能，還有可能將反應(yīng)的活性位點埋藏在樹脂里面，這樣使得反應(yīng)很難進行，目前報道使 用的主要方法有：

使用混合溶劑，DMSO/DMF，6N 胍啶/DMF溶液

提高反應(yīng)溫度，或采用微波方法

使用高離液鹽，LiCl，NaClO4等。

使用溶脹性能更好的PEG-PS樹脂，同時減少樹脂擔(dān)載量（0.05-0.2mmol/g）

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